Зміст
- Виявлення за допомогою зміни кольору
- Використовуючи рідери ELISA для вимірювання
- Прямий конкурентний ІФА (цитохром с)
- Інкубуйте первинне антитіло в пробірках
Тест ELISA є імуноферментним аналізом, який використовує антитіла або антигени, пов'язані з певним ферментом, щоб допомогти визначити концентрацію антитіла або антигену. Якщо ви приймаєте ІФА і не можете використовувати специфічні антитіла для отримання результатів, пропонується конкурентний ІФА, оскільки він використовує антиген, кон'югований з ферментом замість антитіла і інший метод виявлення.
Виявлення за допомогою зміни кольору
Загальним протоколом для конкурентного ELISA є використання немеченого і очищеного первинного антитіла. Антитіло покриває лунки микротитрационного планшета і інкубується з невідомими стандартами. Після цього до кон'югату з первинним антитілом додають иммуноген, який зв'язується з ділянками антитіл, які ще не зайняті. Підкладка потім використовується для створення зміни кольору для вимірювання концентрації зв'язування.
Використовуючи рідери ELISA для вимірювання
Використовують мікротитровану полістиролову пластину і додають первинне антитіло до кожної лунки. Для досягнення максимального зв'язування заповнюють лунку одним мікрограмом антитіла. Інкубуйте планшет протягом чотирьох годин при кімнатній температурі. Додають первинне захоплення антитіла і промивають лунки PBS (забуференний фосфатом фізіологічний розчин). Інкубуйте планшети з блокуючим буфером протягом двох годин при кімнатній температурі. Промивають лунки двічі знову PBS і додають стандарти. Розміщують розчин антиген-кон'югат у лунки і знову інкубують протягом двох годин. Пластину знову промивають PBS чотири рази. Додають субстрат і вимірюють щільності на конкретній довжині хвилі за допомогою зчитувача ELISA.
Прямий конкурентний ІФА (цитохром с)
Для прямого конкурентного ELISA необхідно провести аналіз розведення сироватки для антигену, який використовується в експерименті. Потім планшет для микротитрования покривають цитохромом с і інкубують протягом ночі. Частина аналізу ELISA потім виконують додаванням блокуючого реагенту і вторинного антитіла. Результати поглинання зчитують з допомогою зчитувача мікропланшетів.
Інкубуйте первинне антитіло в пробірках
У цій процедурі первинне антитіло інкубується в пробірках, в яких цікавиться антиген, що представляє інтерес. Потім зразки додають в лунки микротитровальних планшетів і інкубують. Потім лунки промивають для видалення будь-яких незв'язаних комплексів антиген-антитіло, після чого додають блокуючий розчин, щоб запобігти зв'язуванню другого антитіла з лунками. Потім вторинне антитіло зчитують на планшетному рідері для отримання результатів.