Усунення несправностей при гель-електрофорезі

Зміст

Інструкції
Як
Повідомлення
Що вам потрібно

Електрофорез у поліакриламідному гелі, або PAGE, є методикою, що використовується для поділу органічних молекул в біологічному зразку. Молекули меншого розміру і ваги мігрують швидше в поліакриламідний гель, коли застосовується електричний струм. Різкі чіткі смуги зазвичай спостерігаються після того, як завершений гель інкубується в плямі. Це відносно простий метод. Однак відсутність смуг, смуг, які є розмитими або нечіткими, може вказувати на проблему на одному або декількох етапах способу. Необхідно дотримуватися основних рекомендацій для вирішення завдань методу гель-електрофорезу, в яких результати не такі, як очікувалося.

Інструкції

Гель-електрофорез є звичайним методом для поділу білків або зразків ДНК (Jupiterimages / Comstock / Getty Images)

Почніть з кінцевого етапу гель-електрофорезу і працюйте заднім числом. Для гель-електрофорезу останньою стадією є процедура фарбування, яка використовується для спостереження смуг зразків. Під час процесу фарбування дійсно мало проблем. Однак барвник для плям повинен бути добре розчинений у відповідному буфері, перш ніж він буде використаний для фарбування гелю. Перевірте, чи була використана правильна концентрація барвника.
Перевірте джерело живлення. Відсутність смуг може вказувати на те, що конфігурація струму або напруги є занадто високою, і тестові зразки мігрують з гелю. Високі параметри також можуть призвести до швидкого переміщення компонентів зразків через гель, що призводить до поганої роздільної здатності та нечітких смуг. Зразки можуть не мігрувати через гель, якщо конфігурація джерела живлення низька. Зразки також можуть накопичуватися в свердловині, де вони були завантажені, і не мігрувати через гель.
Перевірте рідкий акриламід, який використовується для перетворення поліакриламідного гелю. Як правило, процентний вміст акриламіду, використовуваного для перетворення поліакриламідного гелю, становить від 5% до 15%. Зразки, що складаються з більших молекул, завантажуються на 5% -ний гель, оскільки великі фрагменти рухаються повільніше в гелі з більш високим відсотком акриламіду. Малі молекули завантажують на більш високий відсоток гелю, оскільки низька концентрація гелю не може обробляти менші зразки.
Перевіряють реагенти, що використовуються для полімеризації акриламіду. Поліакриламідний гель утворюється шляхом полімеризації рідкої суміші, що складається з біс-акриламіду і акриламіду. Персульфат амонію і TEMED додають до акриламіду для каталізації утворення гелю. Як правило, акриламід повинен проявляти ознаки полімеризації (утворення гелю) через 15 хвилин після персульфата амонію і TEMED. Полімеризація, що відбувається дуже швидко, є результатом великих кількостей персульфата амонію. Якщо недостатньо, це може викликати неповну або нерівномірну полімеризацію.
Підтвердіть кількість завантажених зразків. Високі концентрації зразків можуть повільно рухатися через гель і знижувати роздільну здатність смуги. Низька концентрація проби не може спостерігатися після фарбування гелю. Ці барвники мають обмеження на мінімальну кількість зразка, який можна візуалізувати внаслідок чутливості до кольору.
Підтвердьте якість завантажених зразків. Солі та інші забруднюючі речовини, присутні в зразку, можуть впливати на переміщення зразка вздовж гелю. Електрофорез є результатом проходження електричного струму через гель, що містить буфер провідного струму; Високі концентрації солей у зразку можуть впливати на рух цього струму через гель. При виділенні зразка, щоб отримати відносно чистий зразок, повинен бути включений комплект для очищення.
Перегляньте літературу або письмовий протокол, щоб визначити, чи правильний "PAGE" був використаний для виконання експерименту. Відсоток акриламіду в "PAGE" є специфічним для розміру зразка для випробування. У літературі також може бути надана конкретна інформація щодо встановлення джерела енергії та швидкості міграції зразка.

Як

Надані рекомендації є загальними для застосування в біологічних дослідженнях.
При вирішенні будь-якої лабораторної процедури найкраще почати з останнього кроку і працювати зворотньо, щоб визначити проблему.

Повідомлення

При роботі з акриламідом і поліакриламідом, носити рукавички. Акриламід є нейротоксичним реагентом і може всмоктуватися через шкіру. Поліакриламід не є нейротоксичним, однак він часто містить неполімеризований акриламід і все ще може вважатися токсичним.