Зміст
Ліза - грецьке слово і означає просто "розділити" або "розкласти". Це хороший опис реакції, яка відбувається з клітинами в буфері лізису, розчин, який розщеплює їх для вилучення їх вмісту. Вчені використовують ці розчини для вилучення ДНК або білків при клітинному аналізі, особливо у випадку бактерій. Тип буфера лізису клітин варіюється залежно від типу експерименту, однак ми згадаємо деякі загальні варіанти.
Буфер і сіль
Буферні розчини стабілізують рН, тоді як клітини проходять процес лізису. Розчин трис-HCL є найпоширенішим буфером для буферизації при рН 8, якщо рН бажаний. HEPES - ще одне поширене буферне рішення в цих експериментах. Хлорид натрію також можна додавати для збільшення іонної сили, загальної концентрації розчинених речовин поза клітинами. Останнє є важливим, оскільки вода може поширюватися на всі клітинні мембрани, від областей з низькою концентрацією розчиненої речовини до тих, що мають високу концентрацію.
Миючий засіб
Миючий засіб - головний інгредієнт, який розчиняє клітинну мембрану, щоб вміст міг вийти. Миючі засоби - це амфіпатичні молекули, тобто з одним кінцем, який легко взаємодіє з молекулами води, тоді як інший гідрофобний кінець, або "який боїться води", не робить цієї взаємодії. Вони можуть розчиняти жири, утворюючи міцели, невеликі групи, в яких гідрофобні хвости молекул миючого засобу спрямовані всередину до молекул жиру. Поширеними миючими засобами є додецилсульфат натрію або SDS, NP-40 та тритонХ.
Хелатні агенти та інгібітори
Буфери для лізису також містять хелатуючі агенти, такі як етилендіамінтетраоцтова кислота (ЕДТА) або тетраоцтова кислота ретиленгліколю (ЕГТА). Ці хімічні речовини зв’язуються з іонами металів із зарядом +2 (наприклад, магнієм та кальцієм), роблячи таким чином їх недоступними для інших реакцій. Багато ДНКаз (білки, що пережовують ДНК) та протеази (білки, які розрізають інші білки) потребують іонів магнію для роботи, тому позбавляючи їх цього основного інгредієнта, ЕДТА та ЕГТА, вони сприяють зниженню рівня протеази або активності ДНКази. Однак вони не повністю їх виключають, а деякі протеази не залежать від кофакторів магнію, тому буфери для лізису іноді містять також речовини, які називаються інгібіторами протеази, які зв’язуються з нею та заважають їй працювати належним чином.
Лужний лізис
Лужний лізис - дуже поширена техніка очищення плазмід від бактерій. Цей метод передбачає використання трьох рішень. Перший містить глюкозу, трис-HCL-буфер, ЕДТА та РНКази. Глюкоза створює високу концентрацію розчиненої речовини поза бактеріями, завдяки чому вони стають трохи в’ялими, полегшуючи процес лізису. ЕДТА та трис-HCL працюють, як описано раніше, тоді як РНКаза пережовує будь-яку РНК всередині клітини, щоб вивести її з дороги. Другий розчин ефективно робить лізис клітин. Він містить миючий засіб SDS і NaOH, який підвищує рН до 12 і вище, денатурируя білки всередині клітини і змушуючи ДНК розділятися на прості нитки. Третій розчин містить ацетат калію для відновлення рН до більш нейтрального рівня, щоб ланцюги плазмідної ДНК могли з’єднуватися. Тим часом денатуровані білки з’єднуються і випадають в осад, тоді як додецилсульфатні іони з’єднуються з іонами калію, утворюючи нерозчинні сполуки, які також можуть випадати в осад з розчину.